x

Misbruik melden

Bedankt dat je Plazilla wilt helpen door schendingen van onze regels en richtlijnen te melden.

Wil je een inbreuk op jouw auteursrecht of intellectuele eigendom melden? Gebruik dan a.u.b. het formulier Inbreuk auteursrecht / intellectuele eigendom

Welke vorm van misbruik wil je melden?




Annuleren

Alles over Dna en Dna technieken

Door DWS gepubliceerd op Friday 28 September 12:14

Wat is DNA? Welke technieken worden gebruikt om genetische modificatie uit te voeren?

DNA

DNA staat voor Desoxyribonucleïnezuur en bewaart de erfelijke informatie van organismen. Het DNA-molecuul bestaat uit twee lange strengen nucleotiden, die in een dubbele helix verbogen zijn. Een nucleotide is een molecuul dat uit drie onderdelen bestaat, namelijk een fosfaatgroep, een suiker met vijf koolstofatomen en een base. Nucleotiden zijn als het ware de bouwstoffen voor DNA en RNA. In het DNA zijn 4 verschillende basen aanwezig: adenine (A), guanine (G), thymine (T) en cytosine (C). Deze basen vormen specifieke paren. Zo is guanine op de ene streng altijd verbonden met cytosine op de andere streng. Dit is hetzelfde voor adenine en thymine. Voor RNA geldt dat er geen thymine, maar uracil (U) aanwezig is. De twee DNA-strengen zijn met elkaar verbonden door waterstofbruggen tussen de basen. De volgorde van deze nucleotiden wordt ook wel de sequentie genoemd. Drie opeenvolgende basen (tripletten of codons) coderen voor een aminozuur en een opeenvolging van tripletten dat codeert voor een eiwit wordt een gen genoemd. Bepaalde tripletten werken als start- en stopcodons, waardoor de lengte van een eiwit gedefinieerd wordt. Zo worden de kenmerken van organismen bepaald. De erfelijke informatie staat opgeslagen op het DNA in de vorm van genen (genotype) en dit komt tot uiting door de eiwitten die vanaf de genen gevormd worden (fenotype). 


Recombinant DNA

De techniek in de wetenschap is zo ver gevorderd, dat het mogelijk is het DNA van organismen aan te passen. Dit betekent dus dat de genetische code op het DNA gemodificeerd wordt. Er wordt een gen dat in een bepaald organisme voor een eiwit codeert in het DNA van een ander organisme geplaatst. Er zijn verschillende technieken om genetische modificatie uit te voeren. 

DNA-technieken

Hieronder wordt de isolatie en restrictie van DNA toegelicht. Ook komt het onderdeel gelelektroforese aan bod en wordt een kwalitatieve controle van het DNA uitgelegd, de nanodrop. Dit zijn verschillende methoden die in onderzoeken toegepast kunnen worden.

DNA-isolatie

Om DNA uit organismen te kunnen onderzoeken, moet dit DNA eerst uit de cellen van het organisme worden geïsoleerd. Hoe dit wordt gedaan, is afhankelijk van het type cel waaruit het DNA verwijderd moet worden. De isolatiemethode wordt in de praktijkplannen in de bijlage verder toegelicht.

DNA-restrictie

Om te bepalen of een bepaald gen in het DNA aanwezig is, wordt gebruik gemaakt van restrictie enzymen (RE’s). RE's zijn enzymen die in staat zijn op specifieke plaatsen in het DNA te ‘knippen’. Hun oorspronkelijk functie is het onschadelijk maken van bacteriële virussen. In het vervolg wordt uitgelegd hoe deze enzymen worden gebuikt om DNA te manipuleren. De plaatsen op het DNA waar de RE’s kunnen knippen worden restrictie-sites genoemd. De enzymen knippen doorgaans op vele plaatsen in het DNA. De ontstane stukjes DNA worden restrictie-fragmenten genoemd.

De restrictie-sites bestaan over het algemeen uit een sequentie van 4 tot 8 nucleotiden en zijn in de vorm van een palindroom. De meest bruikbare RE’s verbreken de suiker-fosfaat verbindingen in DNA  zodanig dat er dubbelstrengs fragmenten met enkelstrengs uiteinden ontstaan. Deze uiteinden worden ‘sticky ends’ genoemd. 

Elk fragment met complementaire sticky ends kan nieuwe (doch dezelfde) basenparen vormen met het bijpassende fragment. Deze verbindingen zijn slechts tijdelijk, maar kunnen permanent gemaakt worden met het enzym DNA ligase. Dit enzym katalyseert de vorming van covalente bindingen die de suiker-fosfaat ruggengraat van het DNA afsluiten. Wanneer de fragmenten bij deze reacties afkomstig zijn van verschillende DNA-moleculen, spreekt men van recombinant DNA. Zo worden RE’s en DNA ligase gebruikt voor genetische manipulatie.

Het is bij experimenten belangrijk dat de eenheid voor enzymactiviteit in acht wordt genomen. Deze eenheid, genaamd ‘unit’ (U), staat niet voor een volume enzym, maar voor de hoeveelheid enzym die de reactie van 1 µmol substraat katalyseert (1 unit). Dit kan per enzym verschillen. Wanneer een bepaalde hoeveelheid substraat (bijvoorbeeld DNA) geknipt moet worden, moet er rekening gehouden worden met de hoeveelheid U/µl.

Nanodrop

Een nanodrop is een spectrofotometer waarbij geen cuvet gebruikt hoeft te worden. Het wordt gebruikt om DNA, RNA en eiwitten mee te kwantificeren. Zoals de naam suggereert is er slechts een zeer kleine hoeveelheid van het te testen monster nodig. 1 µl wordt op het einde van optische vezeldraad gepipetteerd, waarna er een kolom van het monster wordt gevormd, als gevolg van co- en adhesie (oppervlaktespanning).

De absorptie kan vervolgens gemeten worden ten opzichte van een geschikte blanco. Alle resultaten worden verwerkt met een computer waar de nanodrop op is aangesloten. Hierbij wordt niet alleen de absorptie weergegeven, ook worden de concentratie en de zuiverheid berekend.
De concentratie wordt berekend aan de hand van de wet van Lambert-Beer.

In de wet van Lambert-Beer is:
E: Extinctie, eenheidsloos
L: De weglengte (in cm)
c: de concentratie (in mol/l) van de te onderzoeken stof
ε: de molaire extinctie coëfficiënt. (in l/mol/cm).

De molaire extinctie coëfficiënt is een constante horend bij een specifieke stof bij een specifieke golflengte. De zuiverheid, in het geval van DNA en RNA, wordt bepaald aan de hand van de 260/280 ratio. Dit is de verhouding tussen de extincties bij de golflengtes 260 nm en 280 nm in het absorptiespectrum. Beide DNA en RNA hebben een absorptie maximum bij 260 nm. Over het algemeen wordt 1,80 beschouwd als de ratio voor zuiver DNA. RNA, daarentegen, wordt als zuiver beschouwd bij een ratio van 2,00. Dit verschil wordt bepaald door de aanwezigheid van uracil, in plaats van thymine, in het RNA. Wanneer de 260/280 ratio’s van de nucleotiden in DNA en RNA afzonderlijk worden bepaald, blijkt dat deze ratio veel hoger is voor uracil dan voor thymine. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de molaire extinctie coëfficiënt van uracil hoger is dan van thymine. Dit betekent dat bij 260 nm, uracyl meer licht absorbeert dan thymine. 

PCR

PCR staat voor Polymerase Chain Reaction en is een methode om specifieke delen DNA zeer snel te amplificeren. Om gewenste sequenties DNA (bv. een bepaald gen) te kunnen kopiëren, zijn specifieke sequenties RNA nodig die complementair zijn aan de begin- en eindsequenties van het gewenste gen. Deze stukjes RNA worden primers genoemd en zijn doorgaans 18 tot  20 nucleotiden lang. Wanneer het DNA is gedenatureerd kunnen de primers aan het DNA hechten en kan DNA-polymerase de nucleotiden voor de complementaire gaan toevoegen. Zo kan een specifiek deel van het DNA gekopieerd worden. Bij PCR worden de 3 stappen (denaturatie, aanhechting en verlenging) vele malen herhaald om grote hoeveelheden van het gewenste DNA te produceren. 

Bij de denaturatiestap wordt het DNA verhit op een zodanige temperatuur dat de primers niet in staat zijn aan te hechten en DNA-polymerase intact blijft (+/- 90 graden Celsius). Vervolgens wordt de temperatuur teruggebracht zodat de primers aan het DNA kunnen hechten, maar DNA-polymerase niet functioneel is (+/- 60 graden Celsius). Als laatste stap van de cyclus wordt de temperatuur verhoogd tot een optimale waarde voor DNA-polymerase (+/- 72 graden Celsius). Deze cyclus wordt herhaald tot een gewenste hoeveelheid DNA is aangemaakt. 

Gelelektroforese

Gelelektroforese is een techniek om nucleïnezuren en eiwitten te scheiden op basis van grootte en/of elektrische lading. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een gel die gemaakt is van polymeren en een elektrisch veld.

In de gel zijn slotjes gemaakt waar het DNA in gebracht kan worden. Wanneer er een spanning op de gel wordt gezet, zal het DNA van de negatieve naar de positieve pool worden getrokken. Dit komt door de negatief geladen fosfaatgroepen in het DNA. Omdat de gel bestaat uit polymeren die poriën van een bepaalde grootte vormen, ondervinden grote DNA moleculen meer weerstand dan kleine moleculen. Zo wordt het DNA op basis van grootte onderscheiden. Om het DNA zichtbaar te maken, is aan de gel
ethidiumbromide toegevoegd, wat zich tussen de dubbele helix van het DNA schaart. Wanneer het DNA vervolgens met uv-licht wordt beschenen, zal het oplichten door de aanwezige ethidiumbromide (luminescentie). Zo zal een bandenpatroon van DNA zichtbaar worden. Dit bandenpatroon kan vergeleken worden met een standaardbandenpatroon (Molmarker) en zo kunnen de lengtes in basenparen van de verschillende DNA fragmenten bepaald worden. 

 

Reacties (2) 

Voordat je kunt reageren moet je aangemeld zijn. Login of maak een gratis account aan.
Interessant spul blijft dat DNA toch :)
dit gaat mij boven de pet, knap van je dat je dit weet..