Hoe werkt een (UV-VIS) spectrofotometer?

Door Lab Rat gepubliceerd op Tuesday 11 June 23:44

Één van de eerste wetenschappelijke technieken die een beginnend analist of wetenschapper voorgeschoteld krijgt is spectrometrie. Veel practica in het eerste jaar van biochemisch gerichte studies worden zonder spectrofotometer lastig uit te voeren. Maar hoe werkt dat ding eigenlijk?

 

Een spectrofotometer is een instrument dat wordt gebruikt om in een specifiek gebied van het elektromagnetisch spectrum eigenschappen van licht te meten. Meestal wordt de lichtintensiteit gemeten, waarbij de golflengte van het licht de onafhankelijke variabele is. Er zijn spectrofotometers voor  verschillende bereiken, variërend van gammastralen tot röntgenstralen en van UV-straling tot in het verre infrarood. Dit artikel focust zich op zogenaamde UV-VIS spectrofotometers.


In het UV-VIS spectrum wordt de absorptie van UV (ultraviolet) of VIS (visible, zichtbaar) licht gemeten om, met name bij stoffen die dubbele bindingen bevatten, de concentratie van deze stof in een te onderzoeken monster te bepalen.
Alle soorten straling in hel elektromagnetisch spectrum hebben een andere golflengte, variërend van radiogolven, die een golflengte hebben van duizenden meters, tot gammastraling, met een golflengte ter grootte van de kernen van atomen. UV-straling heeft een golflengte van 200 tot 400 nanometer, vergelijkbaar met de grootte van grote moleculen. De golven van zichtbaar licht zijn ongeveer net zo groot als eencellige organismen, tussen de 400 en 800 nanometer.

 

Bij spectrometrie wordt een stof met ofwel UV licht ofwel met zichtbaar licht, van een bepaalde golflengte, bestraald. De moleculen van deze stof kunnen deze straling absorberen. Wanneer een molecuul voldoende van deze stralingsenergie heeft opgenomen, bevindt het zich in de aangeslagen toestand, en heeft het en hogere energie dan in de grondtoestand. Om terug te keren naar deze grondtoestand moet het molecuul deze extra energie kwijt, die vervolgens als licht of warmte vrijkomt. Bij het vrijkomen van licht is er sprake van fluorescentie of fosforescentie.

 

De hoeveelheid licht die een stof absorbeert kan worden gemeten in een spectrofotometer. Deze bestaat uit een stralingsbron, een vak waar het te onderzoeken monster geplaatst kan worden, en een detector. De lichtbron zendt ofwel zichtbaar licht ofwel UV licht uit naar een lens, die zo is afgesteld dat het licht zo veel mogelijk wordt gebundeld. De lichtstraal komt vervolgens aan bij een prisma, die het licht netjes uitsplitst. Door een verschuifbaar luikje wordt alleen licht van een in te stellen golflengte doorgelaten naar het volgende compartiment. In dit compartiment kan het monster worden geplaatst, waar de lichtstraal met een specifieke golflengte doorheen wordt geleidt.

Na het monster staat een detector die de intensiteit van de hoeveelheid doorgelaten licht meet. Een achterliggende processor berekent vervolgens hoeveel licht er geabsorbeerd is met de volgende formule:
A= -log (I/I0)
Hierin is A de absorbantie, ook wel extinctie genoemd, I de intensiteit van het doorgelaten licht en I0 de intensiteit van het opvallende licht. I is uiteraard lager dan I0, omdat een deel van het licht is opgenomen door het monster. De hoeveelheid hiervan is recht evenredig met de concentratie van de stof. Dit verband wordt uitgedrukt met de Wet van Lambert-Beer: E= ε*c*L
Zoals gezegd staat E voor de extinctie of absorbantie, dus de hoeveelheid geabsorbeerd licht. Dit getal heeft geen eenheid.
ε is de molaire extinctiecoëfficiënt in L/(mol*cm), een constantie die karakteristiek is voor iedere stof.
c is de concentratie van de aan te tonen stof in mol/L.
L is de afstand die de stof heeft afgelegd in de oplossing van de te meten stof, en dus de breedte van de gebruikte buis (cuvet) in cm. Over het algemeen hebben cuvetten een breedte van 1 centimeter, waardoor deze variabele uit de formule weg kan vallen.
De concentratie van de te onderzoeken stof kan vervolgens berekend worden door  de moleculaire extinctiecoëfficiënt (maal de weglengte) te delen door de extinctie.

 

Het is ook mogelijk om bij een UV-VIS spectrum te meten. Hierbij wordt er bij elke golflengte (in een bepaald gebied van het te meten spectrum) de extinctie gemeten en deze worden daarna tegen elkaar uitgezet in een grafiek. Uit deze grafiek valt af te leiden bij welke golflengte een maximale absorbantie plaatsvindt, en bij welke golflengte de stof het beste gemeten kan worden.
Voor het meten van een bepaalde stof in een niet zuivere oplossing wordt de golflengte mede bepaald door de absorbanties van andere componenten in de oplossing, deze mogen immers niet te veel storen in de meting, waardoor de te meten stof niet altijd bij het absorbantiemaximum wordt gemeten.

 

Bron afbeeldingen: chi-machine.eu, electrical-res.com

Reacties (0) 

Voordat je kunt reageren moet je aangemeld zijn. Login of maak een gratis account aan.